研究报告
双酚A对三角涡虫DjSOD, DjCAT,DjGPx基因及相关酶活性的影响 
,
邹杨建 
,
吴素格 ,
类艳贝 ,
李娟
作者 通讯作者
水生生物研究, 2015 年, 第 4 卷, 第 11 篇 doi: 10.5376/aor.cn.2015.04.0011
收稿日期: 2015年05月28日 接受日期: 2015年06月25日 发表日期: 2015年07月29日
引用格式(中文)：
张秀芳等, 2015, 双酚A对三角涡虫DjSOD, DjCAT,DjGPx基因及相关酶活性的影响, 基因组学与应用生物学, 34 (6): 1184-1188 (10.13417/j.gab.034.001184)
引用格式(英文)：
Zhang et al., 2015, Effects of BPA on Activity and Gene Expression of Antioxidant Enzymes in Planarian Dugesia japonica (Online), 34 (6): 1184-1188 (10.13417/j.gab.034.001184)
本试验旨在探讨环境内分泌干扰物双酚A(BPA)对涡虫抗氧化酶(SOD, CAT, GPx)的活性及相关基因表达的影响。采用不同浓度的BPA处理涡虫48 h，然后测定抗氧化酶活性，并应用半定量RT-PCR技术探讨相关基因的变化。在BPA胁迫下，SOD活性呈现上升趋势、CAT活性表现出了先上升后下降的趋势，GPx活性总体上变化不大。随BPA浓度的增加，DjSOD mRNA表达量上升，并呈现剂量-反应关系，DjCAT及DjGPx mRNA表达量也呈现出明显的上调现象，但变化趋势并不同于酶活性。BPA诱导涡虫的氧化应激反应，改变抗氧化酶SOD、CAT基因的转录水平。
双酚A (BPA)，学名为2,2-(4-羟基苯基)丙烷，是全球生产量最大的化学原料之一，调查显示，我国2000~2006年间BPA以平均每年13%的速度增长(Huang et al., 2012)。Zhang等(2013)人抽样调查发现，我国84%被测人群尿液中含有BPA，46%被测人群血液中含有BPA。BPA是一类典型的环境内分泌干扰物，具有潜在的生殖发育毒性、免疫毒性、神经毒性、致癌及内分泌干扰等作用，如：诱导斑马鱼胚胎产生氧化应激反应(Wu et al., 2011)，导致鱼类的睾丸结构发生改变，性别分化受到干扰(Mandich et al., 2007)。但至今为止未见对三角涡虫影响的报道。
三角涡虫(Dugesia japonica)属扁形动物门、涡虫纲，具有极强的再生能力, 作为水体污染指示生物之一，以其分布范围广、结构简单、易采集和培养等特点，日益受到众多毒理学研究者的重视。涡虫的DNA 损伤、成体干细胞的微核频率、繁殖及再生等已被用作试验终点来进行生态毒理的研究(Knakievicz and Ferreira, 2008; 袁佐清和宫晓宁, 2014)，但鲜见在基因表达水平的研究。本论文以三角涡虫为实验材料，研究DjSOD、DjCAT DjGPx基因表达量及相关酶活性的变化，为应用涡虫的抗氧化系统评价BPA潜在的风险提供参考。
1结果与分析
1.1双酚A对抗氧化酶活性的影响
染毒各组涡虫均浆液超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)酶活性结果见表1。可以看出，在实验浓度及染毒时间内，SOD活性总体上表现出上升趋势，对照组平均值为9.14 U/mg Prot；但在低浓度时，与对照组相比并没有明显的差异，在浓度高于0.564×10-5 mol/L时，表现出了明显的上升，并在BPA浓度为1.41×10-5 mol/L时达到最大值，为25.16/mg Prot，显著高于其它浓度组(p＜0.05)。CAT活性表现出了先上升后下降的趋势，对照组平均值为33.33 U/mg prot；在BPA浓度为 0.282×10-5 mol/L时达到最大值，为74.29 U/mg prot，之后随着BPA浓度增加CAT 活性反而下降，在BPA浓度为1.41×10-5 mol/L时，为49.52 U/mg prot，但仍明显高于对照组(p＜0.05)。GPx活性总体上变化不大，只在处理浓度为0.564×10-5 mol/L时，与对照组相比表现出了明显的上升(p＜0.05)。
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表 1 BPA对涡虫抗氧化酶活性的影响 Table 1 Effect of BPA on the activity of antioxidant enzymes in planarian Dugesia japonica |
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1.2双酚A对基因表达的影响
BPA诱导涡虫DjSOD、DjCAT、DjGPx mRNA相对表达量变化见图1、图2和图3。结果显示：BPA胁迫均导致三种基因mRNA相对表达量上升。DjSOD mRNA表达量呈现剂量-反应关系，在BPA为0.94×10-5 mol/L，时达到最大值。在BPA为1.41×10-5 mol/L时出现下降，但仍高于对照。DjCAT及DjGPx mRNA表达量也呈现出随BPA浓度增加而增加的现象，但在低浓度时并没有统计学意义。DjCAT mRNA表达量在BPA 0.94×10-5 mol/L时，是对照的1.28倍，在BPA 1.41×10-5 mol/L时，是对照的1.22倍。DjGPx mRNA表达量在BPA 1.41×10-5 mol/L时达到最大值，是对照的1.35倍，表现出显著上调现象。
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图 1 涡虫暴露于BPA (48 h) 0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L时DjSOD mRNA基因表达水平 注: 1~6: BPA浓度分别为0.141×10-5 mol/L、0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L Figure 1 PCR results and relative expression of DjSOD in D.japonica incubated with (48 h) BPA for 0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L Note: 1~6: The D. japonica was exposed to BPA (48 h) for 0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L |
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图 2 涡虫暴露于BPA (48 h) 0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L时DjCAT mRNA基因表达水平 注: 1~6: 分别表示BPA浓度为0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L Figure 2 PCR results and relative expression of DjCAT in D. japonica incubated with (48 h) BPA for 0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L Note: 1~6: The D. japonica was exposed to BPA (48 h) for 0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L |
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图 3 涡虫暴露于BPA (48 h) 0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L时DjGPx mRNA基因表达水平 注: 1~6分别表示BPA浓度为0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L Figure 3 PCR results and relative expression of DjGPx in D. japonica incubated with (48 h) BPA for 0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L Note: 1~6: The D. japonica was exposed to BPA (48 h) for 0.141×10-5 mol/L, 0.282×10-5 mol/L, 0.564×10-5 mol/L, 0.94×10-5 mol/L, 1.41×10-5 mol/L |
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2讨论
双酚A是重要的化工原料，随着工业和经济的迅速发展，其使用量日益增加，并大量排放到环境中，其最终归宿是由各种途径进入水体，对水生生物产生毒害作用。然而，BPA对水生动物生态毒性的研究资料非常少，且多集中在对鱼类毒性的研究(Saili et al., 2011)，对淡水无脊椎动物毒性的研究资料更是相当匮乏(Mihaich et al., 2009)。因此，有必要应用涡虫作为实验材料研究BPA对水生生态系统的毒性。
生物体遭受污染物胁迫时，体内会产生大量自由基，若不及时清除，会在机体内积累并造成氧化损伤，使机体处于氧化应激状态。已有研究表明：持续暴露在低剂量BPA下，小鼠体内抗氧化酶SOD、GPx、CAT活性均下降，并产生较多的丙二醛(MDA)，致使肝肾细胞氧化损伤(王晓梅等, 2013)。曾丽璇等报道：在一定的浓度范围内，河蚬(Corbicula fluminea)体内SOD、CAT活性对水体中BPA反应敏感，可与其它敏感性指标一起作为BPA污染的早期监测指标(曾丽璇等, 2014)。然而，也有学者提出不同的见解，抗氧化酶活性的变化只能间接反映生物体受污染胁迫的程度，且其活性变化是动态过程，将其作为污染物暴露的生物标志物时需考虑多种因素的影响(Faria et al., 2009)。
虽然BPA可能影响抗氧化酶系统，但对其分子机制知之甚少，为了能够更好地理解BPA的氧化应激过程，我们研究了BPA暴露对涡虫抗氧化酶活性及相关基因表达量变化的影响。在实验浓度及染毒时间内，涡虫体内SOD、CAT活性均表现出上升趋势，GPx活性变化不大，或许表明涡虫对前两者的敏感程度高于后者。SOD和CAT活性变化趋势不一致，其成因可能是由于H2O2的来源不只是SOD催化的歧化反应产物，它还可以通过氨基酸或细胞色素P450氧化酶激活等其它途径。DjSOD mRNA相对表达量上升，变化趋势同SOD酶活性，DjCAT mRNA相对表达量在BPA浓度为0.94×10-5 mol/L、1.41×10-5 mol/L时升高，DjGPx mRNA相对表达量在BPA浓度为1.41×10-5 mol/L时升高。然而，变化趋势并不同于CAT及GPx活性的变化。这与一些学者在鱼类的研究结果相似(Jin et al., 2010)。我们推测在涡虫体内，CAT酶活力的变化可能是在后翻译水平调节的。但Hassan等(2012)报道BPA可以降低小鼠体内抗氧化基因的表达，降低抗氧化酶活性，这或许与实验浓度、染毒时间、实验动物及动物的发育时期有关。
BPA暴露可诱导涡虫抗氧化酶(SOD和CAT)显著变化，表明BPA诱导了涡虫的氧化应激反应。相应地，我们的研究证明了抗氧化酶基因的转录水平也发生了变化。
3材料与方法
3.1实验材料
三角涡虫采集于山东博山区泉河头的小溪中，在实验室应用凉开水避光养殖，2~3 d换水1次，每周喂养线虫1次，实验前饥饿5~7 d。双酚A购自阿拉丁公司，AR，实验所用RNAiso Reagent、Oligo (dT)、RNAse Inhibitor、dNTP，RtaseM-MLV、MLVBuffer、Taq酶购自大连宝生物TaKaRa公司，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。SOD、CAT、GPx测定试剂盒购自南京建成生物工程公司。
3.2实验方法
3.2.1双酚A胁迫
先用二甲基亚砜溶解BPA，配成0.001 mol/L贮存液，实验时稀释成所需浓度，试液浓度最高时二甲基亚砜含量低于0.01%。根据毒性实验结果，涡虫48 h LC50值为2.82×10-5 mol/L。设置BPA浓度梯度为48 h LC50值的1/2、1/3、1/5、1/10、1/20，即1.41×10-5 mol/L、0.94×10-5 mol/L、0.564×10-5 mol/L、0.282×10-5 mol/L、0.141×10-5 mol/L，同时设置对照组。每组设置3个平行组，每个平行组选择10条大小相同的涡虫，处理期间置于22℃的恒温培养箱中，培养48 h，每天定时更换实验溶液。
3.2.2酶提取及生化分析
分别取处理组和对照涡虫，放入预冷的研钵中，加入磷酸缓冲液研磨，并用磷酸缓冲液清洗研钵，一并倒入离心管，平衡，4℃，10 000 r/min离心10 min，上清液即为酶液，用于抗氧化酶活性的测定。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和酶液蛋白含量按试剂盒说明书测定(试剂盒购自南京建成生物工程公司)。
3.2.3基因表达
总RNA提取采用Trizol试剂，总RNA经DNAase I处理及纯化后, 采用Reverse Transcriptase M-MLV 进行涡虫总RNA反转录，合成第一链cDNA。应用基因EF2α为内参，使用反转录产物单链cDNA作为模板进行PCR 扩增。SOD、CAT、GPx及EF2α基因的引物见表2。PCR反应：94℃ 5 min；94℃ 30 s；退火40 s；72℃ 45 s；反应30~33个循环，72℃ 10 min，退火温度及反应循环根据各引物变化而变化。电泳并保存图片，应用Gel-Pro analyzer软件进行亮度分析。
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表 2 半定量RT-PCR 引物 Table 2 Sequences of primer pairs used in the real-time quantitative PCR reactions |
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3.2.4数据分析
实验结果以平均值±标准差表示，使用SPSS 16.0软件进行分析，对于有显著差异的与对照组进行LSD比较(p＜0.05)。
作者贡献
邹杨建、李娟和类艳贝负责实验操作及撰写论文；吴素格负责实验技术指导；张秀芳负责设计实验及修改论文。
致谢
本研究由山东省自然基金(No. ZR2014DM015和ZR2013CM011)、国家级大学生创新创业训练计划项目(201410433036)和国家自然基金(No. 31172074)共同资助。
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